文久二年(1862年), 近藤一度獲得了講武所劍術(shù)教授的機(jī)會(huì)。不過終因農(nóng)民出身的身份而沒有被正式采用。

文久三年(1863年)，率試衛(wèi)館天然理心流門人加盟進(jìn)京浪士組。浪士組解散后殘留京都，成為京都守護(hù)松平容保下屬，并與芹澤鴨一派共同成立“新撰組”。響應(yīng)幕府號(hào)召，募集浪人組織新撰組，暗殺前輩和同僚，肅正芹澤鴨與新見錦一派后，近藤勇出任新撰組局長(zhǎng)一職，負(fù)責(zé)取締尊攘派志士的工作。

元治元年(1864年)六月五日，長(zhǎng)州激進(jìn)派維新志士在京都二條池田屋密謀火燒京都，趁亂暗殺佐幕派人物。不料消息泄露，近藤勇率新撰組進(jìn)攻池田屋，將與會(huì)人物一網(wǎng)打盡，令長(zhǎng)州派大傷元?dú)?。因?yàn)槌靥镂菔录?，新撰組一戰(zhàn)成名，成為鎮(zhèn)壓尊攘派志士的急先鋒。

慶應(yīng)四年(1868年)，戊辰戰(zhàn)爭(zhēng)爆發(fā)。京都伏見鳥羽一戰(zhàn)，幕府軍大敗，逃往江戶，組織甲陽鎮(zhèn)撫隊(duì)。在甲裴勝沼、下總國(guó)流山一戰(zhàn)中，為掩護(hù)其他新撰組隊(duì)員及同志撤離，近藤勇向維新政府軍投降。因?yàn)楫?dāng)時(shí)幕府是維新政府“朝敵”，近藤勇投降后，當(dāng)局不許近藤勇以武士身份切腹自盡，而判其斬首，同年4月處斬。

慶應(yīng)四年四月二十五日，在板橋平尾一里冢，近藤勇被斬首，時(shí)年三十五歲(虛歲)。